血吸蟲病診斷標準及處理原則――附錄B
發布時間：2011-08-26 共1頁
血清免疫學檢查（補充件）
B1 環卵沉淀試驗（COPT）
B1.1 常用方法
B1.1.1 蟲卵：熱處理超聲干燥蟲卵粉。以重感染兔血清（接種尾蚴1500～2000條，42天的兔血清）測試環沉率＞30％為合格。
B1.1.2 操作方法：先用熔化的石蠟在潔凈的載玻片兩端分別劃兩條相距20mm的蠟線，在蠟線之間加受檢者血清2滴（0.05～0.10mL），然后用針頭挑取干卵約100～150個，加入血清中，混勻，覆以24mm×24mm蓋玻片，四周用石蠟密封后，置于37℃溫箱中，經48～72h后用低倍（80～100×）顯微鏡觀察反應結果，疑似者應在高倍（400×）顯微鏡下加以識別。
為簡化操作亦可選用預制干卵PVC膜片，只需加入血清，置濕盒中37℃保溫經24h取出，傾去血清，加少量鹽水顯微鏡下觀察反應。
B1.1.3 反應標準：典型的陽性反應為泡狀、指狀或細長卷曲的帶狀沉淀物，邊緣較整齊，有明顯的折光。其中泡狀沉淀物須大于10μm（約相當于兩個紅細胞大小），才能定為陽性。陽性反應的標本片，應觀察100個成熟蟲卵，計算其沉淀率；陰性者必須看完全片。
陰性反應：蟲卵周圍光滑，無沉淀物；或有小于10μm的泡狀沉淀物。
陽性反應的強度和環沉率：
a. “＋”蟲卵周圍出現泡狀、指狀沉淀物的面積小于蟲卵面積的1/4；細長卷曲的帶狀沉淀物小于蟲卵的長徑。
b.“＋＋”蟲卵周圍出現泡狀、指狀沉淀物的面積大于蟲卵面積的1/4；細長卷曲的帶狀沉淀物相當于或超過蟲卵的長徑。
c. “＋＋＋”蟲卵周圍出現泡狀、指狀沉淀物的面積大于蟲卵面積的1/2；細長卷曲的帶狀沉淀物相當于或超過蟲卵長徑的2倍。
B1.2 雙面膠紙條法
B1.2.1 蟲卵：熱處理超聲干燥蟲卵粉。以25mg/mL的重感染兔血清y－球蛋白為標準血清，測試環沉率＞30％為合格。
B1.2.2 操作方法：取國產打有雙圓孔的雙面膠紙（厚度約150μm，圓孔直徑16mm孔，間距8mm），先將其一面的覆蓋紙揭去，然后粘貼于載玻片上，膠紙條須與玻片緊密粘牢，不能留有空隙。然后再揭去膠紙條上面的覆蓋紙，用適宜的滴管滴加2滴約50μL血清于圓孔中，覆以蓋玻片（22mm×22mm）后，置37℃孵箱中，觀察48～72h結果。
B1.2.3 反應標準：同B1.1.3。
B2 間接血球凝集試驗（IHA）
B2.1 常用方法
B2.1.1 抗原：為用葡聚糖凝膠G100初步純化的可溶性血吸蟲卵抗原致敏的綿羊紅細胞。所用綿羊紅細胞先經2.5％戊二醛醛化及1∶5000鞣酸溶液鞣化后再行致敏。致敏后的紅細胞以含10％蔗糖及1％正常兔血清的pH7.2PBS配5％懸液，分裝安瓿低壓凍干封存。每批致敏紅細胞作效價測定，滴度達1∶1280～2560為合格。
B2.1.2 操作方法：
B2.1.2.1 啟開安瓿，每支以1mL蒸餾水稀釋混勻備用。
B2.1.2.2 用微量滴管加4滴（0.025mL/滴）生理鹽水于U型微量血凝反應板第一排第二孔內，第三孔空白，第四孔加1滴。
B2.1.2.3 第一孔內儲存待檢血清，并從中吸取血清1滴加入第二孔內，充分混勻后，吸出兩滴于第三孔和第四孔各加1滴。在第四孔混勻后棄去1滴使第三孔、第四孔血清稀釋度分別為1∶5，1∶10。
B2.1.2.4 用定量吸管吸取致敏紅細胞懸液，于第三孔和第四孔內各加1滴，立即旋轉震搖2min，室溫下靜置1h左右，觀察結果。
B2.1.2.5 每次試驗均應有陽性血清及生理鹽水作陽性和陰性對照。
B2.1.3 結果判斷：
B2.1.3.1 陰性反應為紅細胞全部沉入孔底，肉眼見一邊緣光滑，致密的小圓點。
B2.1.3.2 陽性反應。
＋＋＋＋紅細胞形成薄層凝集，邊緣呈現不規則的皺褶。
＋＋＋ 紅細胞形成薄層凝集，充滿整個孔底。
＋＋ 紅細胞形成薄層凝集，面積較＋＋＋者小。
＋ 紅細胞大部分沉集于孔底，形成一圓點，周圍有少量凝集的紅細胞，肉眼見周邊模糊（或中間出現較為明顯的空白點）。
B2.1.4 反應標準：以血清1∶10稀釋出現陽性反應可判為血吸蟲病患者。
B2.2 二氨酚致敏法
B2.2.1 抗原：為日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原（SEA）及成蟲尿素溶解性抗原（AUA）混合而成，其比例為SEA10mg/L十AUA20mg/L.所用綿羊或人"O"型紅細胞經5％戊二醛醛化后，用二氨酚法致敏。致敏后的紅細胞中加入含10％蔗糖及1％正常兔血清的pH7.2PBS，分裝后凍干保存。每批致敏紅細胞以陽性參考血清作效價測定滴度達1：640～1280，陰性血清及鹽水對照不出現凝集者為合格。
B2.2.2 操作方法
B2.2.2.1 凍干致敏紅細胞為每支0.5mL，使用前用1mL生理鹽水稀釋搖勻。
B2.2.2.2 在“Ｖ”型（90°）血凝板中，將受檢血清用生理鹽水做1：5～1：640倍比稀釋。
B2.2.2.3 除1∶5稀釋孔外，其余每孔加滴（0.03mL）致敏紅細胞，振蕩30s，靜置60～90min觀察反應結果。
B2.2.3 反應標準：以110稀釋孔呈強凝集（＋＋＋）為陽性反應。
B3 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
B3.1 常用方法
B3.1.1 抗原：蟲卵可溶性抗原。
B3.1.2 操作方法
B3.1.2.1 于微量聚苯乙烯塑料板的凹孔中加入0.2mL以pH9.6碳酸鹽緩沖液作1∶3000（或1∶1000，隨抗原效價而定）稀釋的蟲卵抗原，置4℃過夜。
B3.1.2.2 次日傾去抗原，用含有0.05％吐溫－20的磷酸緩沖鹽水（PBS/TpH7.4，0.01mol/L）洗滌3次，每次5min。
B3.1.2.3 于凹孔中加入以PBS/T作1∶200稀釋的受檢者血清0.2mL，37℃ 2h。
B3.1.2.4 傾去血清，以PBS/T洗滌3次，每次5min。
B3.1.2.5 加入以PBS/T作1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）－標記結合物0.2mL，37℃ 2h。
B3.1.2.6 傾去酶標記結合物，以PBS/T洗滌3次，每次5min。
B3.1.2.7 加入0.2mL鄰苯二胺（OPD）底物溶液〔10mg OPD＋pH5.0檸檬酸緩沖液25mL＋30％過氧化氫（H2O2）10μL 0.2mL，37℃，30min。
B3.1.2.8 在各凹孔中加入2mol/L硫酸（H2SO4）0.05mL以中止反應。
B3.1.2.9 在酶標專用比色計上讀取492nm光密度（OD）值。
B3.1.2.10 每次實驗均設陽性參考血清對照，同法求出其OD值。以此對樣本血清OD值進行校正。
B3.1.3 反應標準：據Dynatech酶標專用比色計測定結果OD值≥0.5為血吸蟲陽性。
B3.2 使用純化抗原的ELISA法
B3.2.1 抗原：經50％～75％飽和硫酸銨純化的日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原（AEA）。
B3.2.2 操作方法：
B3.2.2.1 已包被AEA抗原的40孔聚苯乙烯塑料板用前以PBS/T（pH7.4）洗滌1次。
B3.2.2.2 血清用PBS/T稀釋成1∶200，每孔加0.1mL，每份血清加2個孔，置有蓋濕盒內，20-37℃溫育30min。
B3.2.2.3 去盡反應板孔內的液體，用PBS/T灌滿各孔，3～5min后去盡孔內液體，如此反復洗滌3次。
B3.2.2.4 每孔加1∶1000稀釋辣根過氧化物（HRP）酶結合物0.1mL，同B3.2.2.2～B3.2.2.3溫育和洗滌。
B3.2.2.5 加OPD底物溶液（OPD20mg＋pH5.0檸檬酸磷酸鹽緩沖液50mL，用前加30％H2O220μL）0.1mL，同B3.2.2.2溫育。
B3.2.2.6 每孔加2mol/LH2SO425μL，終止反應。
B3.2.2.7 用酶標檢測儀讀取492nm的消光值。每份標本求出2孔實測的OD平均值，再用標準血清予以校正。
B3.2.3 反應標準：每次每板標準血清的OD值應控制在0.79～1.15范圍，若達不到此質控范圍，應重測試。
標本OD值≥0.5判為陽性。
B3.3 PVC薄膜快速酶聯免疫吸附法（ELISA）
B3.3.1 抗原：日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原（SEA）與8mol/L尿素溶解性蟲卵抗原（JEU）等量混合。
B3.3.2 操作方法：
B3.3.2.1 實驗前先在已包被抗原的PVC薄膜背面編號，洗滌液（0.05％吐溫鹽水）洗一次，然后每孔加PBS/T0.2mL.
B3.3.2.2 按編號加入待測血清及參考血清（每批作一個陰性對照，一個陽性對照），每孔10μL，混勻，置37℃ 5min（如放25℃室溫，則10min）。
B3.3.2.3 孵育后，傾去稀釋血清，用洗滌液連續洗8次，控干。
B3.3.2.4 加入按工作濃度稀釋的酶結合物，每孔0.2mL放37℃ 5min。
B3.3.2.5 傾去酶結合物，先用洗滌液洗8次，再用蒸餾水洗一次，控干。
B3.3.2.6 加入已加3％H2O2的四甲基聯苯胺（TMBS）底物液，每孔0.2mL，反應5～10min即可觀察結果。
B3.3.3 反應標準：
B3.3.3.1 目視判斷：按每批的陽性對照及陰性對照判斷結果。陽性為鮮藍色，陰性基本無色。
B3.3.3.2 分光光度計比色判斷：不用H2SO4終止，則選用590nm波長比色，以P/N≥2.1判為陽性（P——病人OD值；N——正常人OD值）。
B4 膠乳凝集試驗（LA）
B4.1 血清標本用生理鹽水1：10稀釋。
B4.2 在反應板（黑色，與妊娠診斷膠乳試驗使用的相同）各格子上分別滴加稀釋血清以及陽性和陰性控制血清各1滴（50μL）。
B4.3 滴加血吸蟲膠乳試劑1滴（50μL），輕輕搖動10min，有清晰凝集者為陽性，不出現凝集者為陰性。
B4.4 1∶10稀釋血清陽性者可進一步倍比稀釋，重復上述測定，呈現凝集的血清最高稀釋度即為抗體滴度。
B5 單克隆抗體斑點酶聯試驗（Dot－ELISA）
B5.1 用取樣環將待測血清點滴至NC纖維膜（以毛面為正面）上，置70℃ 30min或37℃ 2h。將點好的纖維膜連同參考陽性和參考陰性血清的纖維膜一并置染色盤內。
B5.2 將1號試劑（PBS）加200mL蒸餾水，充分溶解后即為PBS溶液。
B5.3 取上述PBS溶液150mL，加2號試劑（吐溫），充分混勻后即為PBS－吐溫溶液。
用此溶液20mL封閉洗滌纖維膜30min，傾去溶液。
B5.4 取3號試劑（單抗酶結合物）加PBS－吐溫溶液10mL，充分混勻后加至含纖維膜的染色盤內。置室溫0.5～1h，中間輕搖數次，傾去溶液。
B5.5 用PBS－吐溫溶液洗滌纖維膜3次，每次5min，傾去溶液。
B5.6 將4號試劑（底物）加PBS溶液（無吐溫）20mL，混勻后再加5號試劑（H2O2）然后加至染色盤中，輕搖數次，15min后傾去底物溶液。用蒸餾水洗滌2次以終止反應。染色后的纖維膜置暗處晾干保存。
B5.7 仔細觀察纖維膜上所呈的顏色反應，并與參考血清所呈現的斑點顯色反應相比較。以斑點色澤超過參考陰性血清者為陽性反應。根據陽性反應強度可判以＋～＋＋＋反應。整理
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