風疹診斷標準及處理原則――附錄B
發布時間：2011-08-26 共1頁
血清學診斷方法
B1 血凝抑制試驗
B1.1 原理
鵝紅細胞（或鴿紅細胞）上有風疹病毒受體，遇風疹病毒可產生凝集現象。若將抗體與病毒（血凝素）預先溫育后再加入紅細胞則不產生凝集，稱為血凝抑制。定量血凝素與不同稀釋度抗體（血清）作用后能完全抑制血凝的最高血清稀釋度，即為血凝抑制抗體效價。
B1.2 主要材料
B1.2.1 血凝板：6×12或8×12個圓形孔（孔底光滑）的U形板。
B1.2.2 定量移液器：定量移液器選用25μL（即0.025mL）。
B1.2.3 尖底小試管：形如離心管，便于血清的吸取。
B1.3 風疹血凝素的制備
取毒種感染BHK21細胞或Vero細胞，常規換液培養。末次換入2％牛血清199綜合培養基，置33℃培養6～7天以上，待細胞病變十十十時收獲，凍化，取上清液用Tween－80乙醚處理即為血凝素；如用白陶土處理的2％牛血清配制感染細胞的培養基來制備血凝素，則不用Tween－80乙醚處理。
B1.4 血凝滴度
所用溶液一律置4℃預冷，微量塑料板法。血凝素用葡萄糖－明膠－巴比妥緩沖液以1∶2倍比遞增稀釋，再加0.25％新鮮鵝紅細胞（或鴿紅細胞）懸液，混勻，置4℃至少1h，觀察結果，以“＋＋＋＋”（4單位）的最高稀釋度為血凝滴度。
B1.5 血凝抑制試驗
原血清0.1mL＋0.7mL氯化錳肝素液，4℃作用20min后在1∶8稀釋的血清中加1滴積壓鵝紅細胞（或鴿紅細胞），1h內搖2～3次，置4℃過夜，再以2000r／min的速度離心10min，取上清液待檢。待檢血清用pH6.2的葡萄糖－明膠－巴比妥緩沖液倍比稀釋后，每孔加0.025mL血凝素（含4單位；如系pH9的血凝素，事先應用0.1mol／L鹽酸調至pH6.2左右再用）。抗原抗體在4℃作用1h后加入0.25％鵝紅細胞1滴（0.025mL），在4℃下作用2h后判定結果，以完全抑制血凝為終點。每次試驗預設以下對照：
陽性血清對照：應出現一定已知效價
陰性血清對照：應出現陰性結果
待檢血清對照：應無非特異性凝集
抗原對照：應出現＋＋＋＋＋（4單位）、＋＋＋（2單位）、＋＋～＋（1單位）、±（1／2單位）的凝集現象
血球對照：應為陽性
HI抗體陽性標準判定以1∶16作為陽性標準。
葡萄糖－明膠－巴比妥緩沖劑（DGV）配制：
巴比妥 0.58g
巴比妥鈉 0.38g
明膠 0.6g
無水CaCl2 0.02g
MgSO44H2O 0.12g
NaCl 8.5g
葡萄糖 10g
巴比妥與明膠可分別先各在250mL蒸餾水中加溫溶解，然后依次加入其他藥品，溶解后加雙蒸水至1000mL，分裝10瓶消毒。用前以0.1mol／L鹽酸將pH調至6.2，用于稀釋待測血清、配制血凝素及紅細胞。
氯化錳－肝素液配制
MnCl2 3.96g
肝素 16萬單位
加雙蒸水至100mL，使用時以雙蒸水稀釋4倍（1∶3）。
B2 酶聯免疫吸附法檢測風疹IgG抗體（ELISA間接法）
B2.1 原理
將風疹抗原包被于固相載體上，加上待檢血清，再用酶標抗抗體間接檢出特異性抗體。
B2.2 材料
B2.2.1 聚苯乙烯酶標板。
B2.2.2 風疹陰性和陽性血清。
B2.2.3 風疹抗原。
B2.2.4 抗入IgG辣根過氧化物酶結合物。
B2.2.5 酶底物鄰苯二胺－雙氧水。
B2.3 操作程序
B2.3.1 用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋風疹抗原與未感染風疹病毒的細胞抗原（對照抗原）。
B2.3.2 于40孔聚苯乙烯板的單排孔與雙排孔分別加入0.1mL／孔的風疹抗原與對照抗原。右下最后一孔不加任何抗原作為空白對照，4℃過夜。
B2.3.3 以0.05％Tween 20生理鹽水（NS－T）洗板三次，倒去洗液。
B2.3.4 在血凝板中以2％牛血清NS－T將待測血清稀釋成1：20～1：1280四個稀釋度，每個稀釋度加風疹抗原與對照抗原各1孔（0.1mL，下同），輕輕振搖后置37℃1～2h.
B2.3.5 以NS－T洗三次，倒去洗液后每孔加入以2％牛血清NS－T稀釋的抗人IgG辣根過氧化物酶結合物0.1mL（空白對照不加），置37℃1～2h。
B2.3.6 以NS－T洗三次，倒去洗液后加鄰苯二胺－雙氧水底物液，每孔0.1mL（包括空白對照孔），避光在37℃放置10～20min，隨時觀察，待對照孔開始顯淡黃色時即用2mol／L硫酸終止，每孔加50μL。
B2.3.7 用空白對照孔調零點，以酶標儀（492nm）測定各孔OD值。OD值不足0.05者按0.05計。凡同一稀釋度下風疹抗原孔OD值／對照抗原孔OD值＞2.1即P／N為陽性。陽性之最高稀釋度的倒數即為該血清的抗體效價。小于1∶20者視為陰性。
B2.3.8 每次實驗應作已知效價的陽性及陰性血清對照。
B3 酶聯免疫吸附法檢測風疹IgM抗體（抗體捕捉ELISA法）
B3.1 原理
利用包被在固相載體上的抗人IgMμ鏈抗體，捕捉待檢血清中的IgM，再用風疹病毒抗原和已知的酶標風疹病毒抗體去檢測血清中IgM是否為抗風疹抗體。利用底物使酶顯色而測知。
B3.2 材料
B3.2.1 聚苯乙烯40孔或96孔板。
B3.2.2 抗人IgMμ鏈抗體。
B3.2.3 風疹病毒抗原和正常對照抗原。
B3.2.4 抗風疹病毒抗體（單克隆或多克隆）。
B3.2.5 酶標抗抗體：抗風疹病毒抗體和酶標抗抗體也可用酶標抗風疹病毒抗體代替。
B3.2.6 酶底物－鄰苯二胺及雙氧水。
B3.2.7 已知的風疹IgM抗體陽性和陰性血清。
B3.2.8 包被液：0.05mol／L碳酸鹽緩沖液（PH9.6）
無水碳酸鈉 159mg
碳酸氫鈉 293mg，使用不超過2周
蒸餾水 加至100mL
B3.2.9 洗滌液（NS－T）：0.85％鹽水的吐溫液
氯化鈉 17g
吐溫 201.0mL
蒸餾水 加至2000mL
B3.2.10 稀釋液為5％牛血清的NS－T液。
B3.2.11 鄰苯二胺－過氧化氫底物液
先配檸檬酸磷酸緩沖液（PH5.0）：
磷酸氫二鈉 18.41g
檸檬酸 5.1g
蒸餾水 加至1000mL，分小瓶冰凍保存
臨用時配底物液：
鄰苯二胺（OPD）4mg
檸檬酸磷酸緩沖液10mL
30％雙氧水 5mL
B3.3 操作
B3.3.1 包被抗人IgMμ鏈抗體，每孔100μL。
B3.3.2 4℃過夜，倒掉液體，用10％牛血清NS－T液120μL封閉。
B3.3.3 37℃1h后倒去封閉液，洗三次。
B3.3.4 加待測血清（1∶100稀釋，即1μL待測血清加100μL稀釋液），每孔100μL.每份血清加2孔（或4孔），37℃2h后洗三次。
B3.3.5 加風疹抗原于1孔（或2孔）中，每孔100μL；另1孔（或2孔）中加正常對照抗原，4℃過夜后，洗三次。
B3.3.6 加風疹單克隆抗體每孔100μL，37℃1.5h后倒去抗體，洗三次。
B3.3.7 加酶標記的抗鼠抗體，每孔100μL，37℃1.5h后倒去抗鼠抗體，洗4次，扣干。
B3.3.6與B3.3.7兩步，亦可用加酶標抗風疹單克隆（或多克隆）抗體一步所取代，每孔加100μL，37℃水浴2h，洗三次再扣干。
B3.3.8 加底物鄰苯二胺－雙氧水，每孔100μL，37℃10～20min。
B3.3.9 加終止酶的反應液即2mol／L硫酸，50μL／孔，判定結果。
B3.4 結果的判定
B3.4.1 肉眼判定法：待檢血清與風疹抗原孔呈明顯的棕色反應，正常對照抗原孔不（或微）顯色，兩者能用肉眼明顯察覺者即為陽性。
B3.4.2 用酶標儀的492nm光源測OD值，血清的P／N≥2.1時為陽性（P為待測血清與風疹抗原作用的OD值，N為待測血清與正常對照抗原作用的OD值）。
在用待測血清與已知風疹陰性血清對比時，則P為待測血清與風疹抗原作用后的OD值，N為標本陰性血清與風疹抗原作用后OD值。整理
更多訪問：，
