感染性腹瀉的診斷標準及處理原則――附錄A
發布時間：2011-08-26 共1頁
病原學診斷方法
A1 沙門菌的檢驗
A1.1 標本的收集
腹瀉流行或爆發時，依據患者的數量及分布范圍，決定采取標本的份數。所采集的糞便標本應盡快送檢。運送時間超過2h者，標本應放入Cary－Blair運送培養基中，在冰浴條件下送檢。
A1.2 分離方法
一般取糞便接種一個強選擇性培養基（如SS瓊脂），一個弱選擇性培養基（如麥康凱平板），37℃培養。從培養物挑選可疑菌落作進一步生化鑒定。
A1.3 血清學鑒定
系用O、H、Vi因子血清與待檢菌株作玻片凝集試驗，先用O因子血清確定其所屬O群及其O抗原的各種成分，再用H因子血清檢查其第一相和第二相的H抗原以確定血清型，必要時還要用Vi血清檢查。
A1.4 菌型的判定和結果報告
綜合生化反應和血清學檢查結果，查對抗原表，判定菌型并報告結果。
A2 腸致瀉性大腸桿菌檢驗
A2.1 患者糞便標本的收集（同A1.1）
A2.2 分離培養
用接種環蘸取新鮮糞便標本接種于下列培養基：
a）麥康凱瓊脂或伊紅－美藍瓊脂等對大腸桿菌抑制性較弱的選擇性鑒別培養基，大腸桿菌發酵乳糖，在麥康凱瓊脂呈桃紅色不透明菌落；
b）山梨醇麥康凱瓊脂（以1％山梨醇代替乳糖），腸出血性大腸桿菌及某些腸致病性大腸桿菌遲緩發酵山梨醇，菌落為無色；
c）血瓊脂平板，用于觀察腸致病性大腸桿菌的溶血及與其他菌落的鑒別。
標本接種培養基后，37℃培養18～24h觀察結果。
A2.3 初步鑒定
挑取可疑菌落作生化反應及與大腸桿菌多價血清作玻片凝集試驗，陽性者作進一步鑒定。
A2.4 鑒定
A2.4.1 腸致病性大腸桿菌（EPEC）
a）標本：嬰幼兒水樣或蛋花湯樣便；
b）生化反應符合大腸桿菌特征；
c）血清學鑒定符合EPEC血清型。
A2.4.2 腸產毒性大腸桿菌（ETEC）
a）標本：霍亂樣水樣便；
b）生化反應符合大腸桿菌特征；
c）血清學鑒定符合ETEC血清型（表A1）；
d）檢出大腸桿菌不耐熱腸毒素（LT）和／或耐熱腸毒素（ST）。測定LT可用兔腸段結扎試驗、皮膚試驗、ELISA、Biken試驗、平板免疫溶血試驗、DNA探針雜交和聚合酶鏈反應（PCR）等方法，各實驗室可根據其條件及習慣選用其中之一。
A2.4.3 腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）
a）標本：細菌性痢疾樣便；
b）生化反應：不發酵或遲緩發酵乳糖，不產氣，除O124外無動力，酒石酸鹽陰性，賴氨酸脫羧酶陰性；
c）血清學鑒定符合EIEC血清型；
d）豚鼠角膜結膜試驗（Sereny試驗）或Hela細胞侵入試驗陽性。
A2.4.4 腸出血性大腸桿菌（EHEC）
a）標本：早期為水樣便，后為血便；
b）生化反應：遲緩發酵山梨醇，在山梨醇麥康凱瓊脂平板上菌落呈白色；
c）血清學鑒定：其血清型為O157：H，或O26：K62：H11；
d）產生Vero細胞毒（VT）。
A3 致瀉性弧菌的檢驗
A3.1 患者糞便標本的收集（同A1.1，標本在室溫條件下運送和保存）。
A3.2 分離培養
A3.2.1 直接分離：采得的標本可直接劃種于分離培養基，37℃培養過夜。培養基可選用非選擇性或選擇性培養基，常用的非選擇性培養基有營養瓊脂和含5％羊血球瓊脂，選擇性培養基有弧菌瓊脂、慶大霉素瓊脂、4號瓊脂、TCBS等。
A3.2.2 增菌后分離：收到標本后在直接分離的同時接種堿性蛋白胨水，于37C增菌6～8h后劃種選擇性培養基或非選擇性培養基，37℃培養過夜。
A3.3 初步鑒定
挑選可疑菌落作氧化酶、動力、O／129敏感性檢查及O1和O139霍亂弧菌診斷血清玻片凝集試驗。符合弧菌性狀但在O1和O139霍亂弧菌診斷血清不發生凝集者進一步作系統鑒定。在O1或O139診斷血清發生凝集者可報告檢出O1或O139群霍亂弧菌，按相應標準處理。
A3.4 鑒定
對檢出的弧菌進一步作系統鑒定，判定結果。
A4 空腸彎曲菌的檢驗
A4.1 標本的收集（同A1.1）
A4.2 標本的檢查
急性期患者的糞便可直接作涂片檢查，革蘭氏染色或用0.3％堿性復紅單染色，鏡檢為革蘭氏陰性、細長、彎曲、呈S形或“海鷗展翅”狀、無芽胞。液體標本在暗視野顯微鏡下可見“射標運動”樣的動力。
A4.3 分離培養
本菌為微需氧菌，在含有5％氧氣時生長最好，此外，還需要二氧化碳，可以使用：①混合氣體法；②燭缸培養法。分離用的培養基有布氏瓊脂培養基、Campy－BAP培養基、Skirrow培養基、卵黃鹽水培養基、巧克力豬血水瓊脂及代血鐵鹽培養基等。為抑制雜菌生長，提高檢出率，可于培養基中加入萬古霉素（6mg／L）、兩性霉素（2mg／L）、磺胺增效劑（5mg／L）、多粘菌素B（4mg／L）。
A4.3.1 直接分離培養：使用布氏瓊脂等進行分離培養，取數接種環糞便劃線涂于分離平皿上，在37C或42℃微需氧環境中培養1～3天，如未見生長，應繼續培養1～2天，空腸彎曲菌和結腸彎曲菌在42℃條件下培養，胎兒彎曲菌應置37C培養。
A4.3.2 增菌后分離培養：將大約0.1g糞便標本置液體增菌培養基內，于42℃微需氧條件下培養2～3天，然后再用前述的一種培養基分離培養。
A4.3.3 初步鑒定：根據過氧化氫酶的產生，彎曲菌可分兩個群，產生過氧化氫酶的有胎兒彎曲菌和空腸／結腸彎曲菌，不產生過氧化氫酶的有唾液彎曲菌。從分離培養基上挑取可疑菌落，結合顯微鏡形態觀察，用相差顯微鏡觀察動力。同時以培養物涂片，革蘭氏染色后證實為革蘭氏陰性的小桿菌，同時作氧化酶和過氧化氫酶試驗均為（＋），對符合彎曲菌屬特性的培養物可做進一步鑒別。
A4.4 生化試驗
不發酵也不氧化糖類，V－P、甲基紅、靛基質、檸檬酸鹽、尿素、丙二酸鹽、明膠。霍亂紅試驗均為陰性。賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶陰性，不分解精氨酸，無脂酶活性，不產生色素。氧化酶、過氧化氫酶陽性。在TTC培養基上菌苔呈紫色有光澤，甘氨酸培養基表面生長似霧狀。
A4.5 血清學分型
生化反應確定為空腸彎曲菌以后，可采用被動血凝試驗或玻片凝集試驗進行血清學分型。
A5 小腸結腸炎耶爾森菌的檢驗
A5.1 標本的收集（同A1.1）
A5.2 分離方法
可直接接種于SS瓊脂或麥康凱培養基等選擇性瓊脂平皿上，22～30℃培養24～48h。同時取約1g標本接種于10mL pH7.4～7.6PBS，混勻后放0～4℃，培養1日和3周時取增菌培養物按上法分離培養，同時再轉種于改良氯化鎂孔雀綠增菌液或其他增菌液，22～30℃培養1～2日后分離。
A5.3 挑選可疑菌落
耶爾森菌生長在麥康凱（MAC）培養基上，25℃24h達1～2mm，48h可達3mm，菌落為灰白色或桃紅色，不發酵乳糖，部分菌株有一個不整齊的透明邊緣，如用解剖鏡或顯微鏡觀察菌落，更易于識別。挑選半透明、光滑、不帶青色光澤的菌落。耶爾森菌生長在SS培養基上菌落類似MAC培養基上的菌落，但稍小，菌落光滑，無色，大小類似痢疾桿菌菌落。可種三糖鐵培養基，經1天、2天、7天各觀察一次，取在斜面和底層產酸不產氣，H2S陰性者進一步進行鑒定。
A5.4 生化鑒定
耶爾森菌的鑒定主要依靠生化反應，其特征為氧化酶、苯丙氨酸脫氨酶、賴氨酸和精氨酸脫羧酶呈陰性，在22～25℃下多數菌株有動力，少數菌株無動力；在37℃下無動力，甲基紅、尿素酶、硝酸鹽還原，鳥氨酸脫羧酶和β－半乳糖苷酶呈陽性，能發酵甘露醇、甘露糖、山梨醇和L－樹膠醛糖。
A5.5 血清學檢查
本菌具有菌體O抗原和鞭毛H抗原。用現在國際常報告的80多個O抗原因子，可將本菌分成不同血清型。目前我國已報告的血清型有54個。
A6 輪狀病毒檢驗
A6.1 糞便標本的收集
收集患者早期腹瀉糞便約10g或10mL，置無菌試管內，冰壺冷藏運送至實驗室，－20℃保存至檢驗。
A6.2 標本可采用下列兩方法之一檢驗
A6.2.1 ELISA檢測法：國內已有商品試劑盒供應，也可自行配制，試驗按常規法進行。
A6.2.2 輪狀病毒RNA聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法：按常規方法進行，依據電泳圖型判定結果。
A6.2.2.1 輪狀病毒：A組輪狀病毒是嬰幼兒病毒腹瀉的主要病原，電泳圖可見11條RNA區帶，分四組，其排列為4.2.3.2.依據第Ⅳ組10和11RNA片段電泳距離不同，把輪狀病毒分為兩個亞群：亞群I為短型（S型），兩片段距離短；亞群Ⅱ為長型（L型），兩片段距離長。
A6.2.2.2 成人腹瀉輪狀病毒：為B組輪狀病毒，主要引起青壯年腹瀉。11條RNA電泳圖的分布模式為4.2.1.1.1.1.1（或描述為4.2.2.3），第7.8.9節段明顯分開，易于與一般輪狀病毒區別。
A6.2.2.3 腺病毒電泳圖：腺病毒為DNA病毒，在電泳中只見一條粗大的DNA區帶，且高于輪狀病毒第一條區帶，易于與輪狀病毒鑒別。
A7 藍氏賈第鞭毛蟲的檢驗
A7.1 標本的收集
A7.1.1 患者糞便標本的收集：同A1.1。
A7.1.2 采取十二指腸抽出液，用作膽道感染的診斷，也可提高腸道感染的檢出率。
A7.1.3 采取患者血液，分離出血清，檢查其中的特異性抗體，可提高腸道感染的檢出率。
A7.2 實驗診斷
A7.2.1 病原學檢查：賈第蟲在發育過程中有滋養體和包囊2期。
A7.2.1.1 滋養體的檢查：滋養體在腹瀉病人的糞便和十二指腸液中，可用生理鹽水直接涂片，用光學顯微鏡檢查。形態從正面觀呈倒置縱切梨性，前端鈍圓，后端尖細，大小為（12～15）μm×（6～8）μm，厚2～4μm。側面觀呈瓢狀，背面隆起，腹部內陷形成吸盤。在新鮮標本，蟲體靠鞭毛擺動很活潑。
A7.2.1.2 包囊的檢查：包囊出現在成形糞便或十二指腸液中，可用碘液染色法、乙醚蟻醛沉淀法和硫酸鋅離心浮聚法檢查。包囊的形成呈間歇性，宜隔天檢查，連續3天。包囊呈橢圓形，大小為（8～12）μm×（7～10）μm.囊壁與蟲體之間有明顯的不均勻空隙，成熟包囊內有4個核。
A7.2.2 血清學檢查：患者血清中有對藍氏賈第鞭毛蟲的特異性抗體，可用血清學試驗作診斷。血清學檢查可使用間接血凝試驗，間接熒光抗體試驗或ELISA等方法。整理
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A1 沙門菌的檢驗
A1.1 標本的收集
腹瀉流行或爆發時，依據患者的數量及分布范圍，決定采取標本的份數。所采集的糞便標本應盡快送檢。運送時間超過2h者，標本應放入Cary－Blair運送培養基中，在冰浴條件下送檢。
A1.2 分離方法
一般取糞便接種一個強選擇性培養基（如SS瓊脂），一個弱選擇性培養基（如麥康凱平板），37℃培養。從培養物挑選可疑菌落作進一步生化鑒定。
A1.3 血清學鑒定
系用O、H、Vi因子血清與待檢菌株作玻片凝集試驗，先用O因子血清確定其所屬O群及其O抗原的各種成分，再用H因子血清檢查其第一相和第二相的H抗原以確定血清型，必要時還要用Vi血清檢查。
A1.4 菌型的判定和結果報告
綜合生化反應和血清學檢查結果，查對抗原表，判定菌型并報告結果。
A2 腸致瀉性大腸桿菌檢驗
A2.1 患者糞便標本的收集（同A1.1）
A2.2 分離培養
用接種環蘸取新鮮糞便標本接種于下列培養基：
a）麥康凱瓊脂或伊紅－美藍瓊脂等對大腸桿菌抑制性較弱的選擇性鑒別培養基，大腸桿菌發酵乳糖，在麥康凱瓊脂呈桃紅色不透明菌落；
b）山梨醇麥康凱瓊脂（以1％山梨醇代替乳糖），腸出血性大腸桿菌及某些腸致病性大腸桿菌遲緩發酵山梨醇，菌落為無色；
c）血瓊脂平板，用于觀察腸致病性大腸桿菌的溶血及與其他菌落的鑒別。
標本接種培養基后，37℃培養18～24h觀察結果。
A2.3 初步鑒定
挑取可疑菌落作生化反應及與大腸桿菌多價血清作玻片凝集試驗，陽性者作進一步鑒定。
A2.4 鑒定
A2.4.1 腸致病性大腸桿菌（EPEC）
a）標本：嬰幼兒水樣或蛋花湯樣便；
b）生化反應符合大腸桿菌特征；
c）血清學鑒定符合EPEC血清型。
A2.4.2 腸產毒性大腸桿菌（ETEC）
a）標本：霍亂樣水樣便；
b）生化反應符合大腸桿菌特征；
c）血清學鑒定符合ETEC血清型（表A1）；
d）檢出大腸桿菌不耐熱腸毒素（LT）和／或耐熱腸毒素（ST）。測定LT可用兔腸段結扎試驗、皮膚試驗、ELISA、Biken試驗、平板免疫溶血試驗、DNA探針雜交和聚合酶鏈反應（PCR）等方法，各實驗室可根據其條件及習慣選用其中之一。
A2.4.3 腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）
a）標本：細菌性痢疾樣便；
b）生化反應：不發酵或遲緩發酵乳糖，不產氣，除O124外無動力，酒石酸鹽陰性，賴氨酸脫羧酶陰性；
c）血清學鑒定符合EIEC血清型；
d）豚鼠角膜結膜試驗（Sereny試驗）或Hela細胞侵入試驗陽性。
A2.4.4 腸出血性大腸桿菌（EHEC）
a）標本：早期為水樣便，后為血便；
b）生化反應：遲緩發酵山梨醇，在山梨醇麥康凱瓊脂平板上菌落呈白色；
c）血清學鑒定：其血清型為O157：H，或O26：K62：H11；
d）產生Vero細胞毒（VT）。
A3 致瀉性弧菌的檢驗
A3.1 患者糞便標本的收集（同A1.1，標本在室溫條件下運送和保存）。
A3.2 分離培養
A3.2.1 直接分離：采得的標本可直接劃種于分離培養基，37℃培養過夜。培養基可選用非選擇性或選擇性培養基，常用的非選擇性培養基有營養瓊脂和含5％羊血球瓊脂，選擇性培養基有弧菌瓊脂、慶大霉素瓊脂、4號瓊脂、TCBS等。
A3.2.2 增菌后分離：收到標本后在直接分離的同時接種堿性蛋白胨水，于37C增菌6～8h后劃種選擇性培養基或非選擇性培養基，37℃培養過夜。
A3.3 初步鑒定
挑選可疑菌落作氧化酶、動力、O／129敏感性檢查及O1和O139霍亂弧菌診斷血清玻片凝集試驗。符合弧菌性狀但在O1和O139霍亂弧菌診斷血清不發生凝集者進一步作系統鑒定。在O1或O139診斷血清發生凝集者可報告檢出O1或O139群霍亂弧菌，按相應標準處理。
A3.4 鑒定
對檢出的弧菌進一步作系統鑒定，判定結果。
A4 空腸彎曲菌的檢驗
A4.1 標本的收集（同A1.1）
A4.2 標本的檢查
急性期患者的糞便可直接作涂片檢查，革蘭氏染色或用0.3％堿性復紅單染色，鏡檢為革蘭氏陰性、細長、彎曲、呈S形或“海鷗展翅”狀、無芽胞。液體標本在暗視野顯微鏡下可見“射標運動”樣的動力。
A4.3 分離培養
本菌為微需氧菌，在含有5％氧氣時生長最好，此外，還需要二氧化碳，可以使用：①混合氣體法；②燭缸培養法。分離用的培養基有布氏瓊脂培養基、Campy－BAP培養基、Skirrow培養基、卵黃鹽水培養基、巧克力豬血水瓊脂及代血鐵鹽培養基等。為抑制雜菌生長，提高檢出率，可于培養基中加入萬古霉素（6mg／L）、兩性霉素（2mg／L）、磺胺增效劑（5mg／L）、多粘菌素B（4mg／L）。
A4.3.1 直接分離培養：使用布氏瓊脂等進行分離培養，取數接種環糞便劃線涂于分離平皿上，在37C或42℃微需氧環境中培養1～3天，如未見生長，應繼續培養1～2天，空腸彎曲菌和結腸彎曲菌在42℃條件下培養，胎兒彎曲菌應置37C培養。
A4.3.2 增菌后分離培養：將大約0.1g糞便標本置液體增菌培養基內，于42℃微需氧條件下培養2～3天，然后再用前述的一種培養基分離培養。
A4.3.3 初步鑒定：根據過氧化氫酶的產生，彎曲菌可分兩個群，產生過氧化氫酶的有胎兒彎曲菌和空腸／結腸彎曲菌，不產生過氧化氫酶的有唾液彎曲菌。從分離培養基上挑取可疑菌落，結合顯微鏡形態觀察，用相差顯微鏡觀察動力。同時以培養物涂片，革蘭氏染色后證實為革蘭氏陰性的小桿菌，同時作氧化酶和過氧化氫酶試驗均為（＋），對符合彎曲菌屬特性的培養物可做進一步鑒別。
A4.4 生化試驗
不發酵也不氧化糖類，V－P、甲基紅、靛基質、檸檬酸鹽、尿素、丙二酸鹽、明膠。霍亂紅試驗均為陰性。賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶陰性，不分解精氨酸，無脂酶活性，不產生色素。氧化酶、過氧化氫酶陽性。在TTC培養基上菌苔呈紫色有光澤，甘氨酸培養基表面生長似霧狀。
A4.5 血清學分型
生化反應確定為空腸彎曲菌以后，可采用被動血凝試驗或玻片凝集試驗進行血清學分型。
A5 小腸結腸炎耶爾森菌的檢驗
A5.1 標本的收集（同A1.1）
A5.2 分離方法
可直接接種于SS瓊脂或麥康凱培養基等選擇性瓊脂平皿上，22～30℃培養24～48h。同時取約1g標本接種于10mL pH7.4～7.6PBS，混勻后放0～4℃，培養1日和3周時取增菌培養物按上法分離培養，同時再轉種于改良氯化鎂孔雀綠增菌液或其他增菌液，22～30℃培養1～2日后分離。
A5.3 挑選可疑菌落
耶爾森菌生長在麥康凱（MAC）培養基上，25℃24h達1～2mm，48h可達3mm，菌落為灰白色或桃紅色，不發酵乳糖，部分菌株有一個不整齊的透明邊緣，如用解剖鏡或顯微鏡觀察菌落，更易于識別。挑選半透明、光滑、不帶青色光澤的菌落。耶爾森菌生長在SS培養基上菌落類似MAC培養基上的菌落，但稍小，菌落光滑，無色，大小類似痢疾桿菌菌落。可種三糖鐵培養基，經1天、2天、7天各觀察一次，取在斜面和底層產酸不產氣，H2S陰性者進一步進行鑒定。
A5.4 生化鑒定
耶爾森菌的鑒定主要依靠生化反應，其特征為氧化酶、苯丙氨酸脫氨酶、賴氨酸和精氨酸脫羧酶呈陰性，在22～25℃下多數菌株有動力，少數菌株無動力；在37℃下無動力，甲基紅、尿素酶、硝酸鹽還原，鳥氨酸脫羧酶和β－半乳糖苷酶呈陽性，能發酵甘露醇、甘露糖、山梨醇和L－樹膠醛糖。
A5.5 血清學檢查
本菌具有菌體O抗原和鞭毛H抗原。用現在國際常報告的80多個O抗原因子，可將本菌分成不同血清型。目前我國已報告的血清型有54個。
A6 輪狀病毒檢驗
A6.1 糞便標本的收集
收集患者早期腹瀉糞便約10g或10mL，置無菌試管內，冰壺冷藏運送至實驗室，－20℃保存至檢驗。
A6.2 標本可采用下列兩方法之一檢驗
A6.2.1 ELISA檢測法：國內已有商品試劑盒供應，也可自行配制，試驗按常規法進行。
A6.2.2 輪狀病毒RNA聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法：按常規方法進行，依據電泳圖型判定結果。
A6.2.2.1 輪狀病毒：A組輪狀病毒是嬰幼兒病毒腹瀉的主要病原，電泳圖可見11條RNA區帶，分四組，其排列為4.2.3.2.依據第Ⅳ組10和11RNA片段電泳距離不同，把輪狀病毒分為兩個亞群：亞群I為短型（S型），兩片段距離短；亞群Ⅱ為長型（L型），兩片段距離長。
A6.2.2.2 成人腹瀉輪狀病毒：為B組輪狀病毒，主要引起青壯年腹瀉。11條RNA電泳圖的分布模式為4.2.1.1.1.1.1（或描述為4.2.2.3），第7.8.9節段明顯分開，易于與一般輪狀病毒區別。
A6.2.2.3 腺病毒電泳圖：腺病毒為DNA病毒，在電泳中只見一條粗大的DNA區帶，且高于輪狀病毒第一條區帶，易于與輪狀病毒鑒別。
A7 藍氏賈第鞭毛蟲的檢驗
A7.1 標本的收集
A7.1.1 患者糞便標本的收集：同A1.1。
A7.1.2 采取十二指腸抽出液，用作膽道感染的診斷，也可提高腸道感染的檢出率。
A7.1.3 采取患者血液，分離出血清，檢查其中的特異性抗體，可提高腸道感染的檢出率。
A7.2 實驗診斷
A7.2.1 病原學檢查：賈第蟲在發育過程中有滋養體和包囊2期。
A7.2.1.1 滋養體的檢查：滋養體在腹瀉病人的糞便和十二指腸液中，可用生理鹽水直接涂片，用光學顯微鏡檢查。形態從正面觀呈倒置縱切梨性，前端鈍圓，后端尖細，大小為（12～15）μm×（6～8）μm，厚2～4μm。側面觀呈瓢狀，背面隆起，腹部內陷形成吸盤。在新鮮標本，蟲體靠鞭毛擺動很活潑。
A7.2.1.2 包囊的檢查：包囊出現在成形糞便或十二指腸液中，可用碘液染色法、乙醚蟻醛沉淀法和硫酸鋅離心浮聚法檢查。包囊的形成呈間歇性，宜隔天檢查，連續3天。包囊呈橢圓形，大小為（8～12）μm×（7～10）μm.囊壁與蟲體之間有明顯的不均勻空隙，成熟包囊內有4個核。
A7.2.2 血清學檢查：患者血清中有對藍氏賈第鞭毛蟲的特異性抗體，可用血清學試驗作診斷。血清學檢查可使用間接血凝試驗，間接熒光抗體試驗或ELISA等方法。整理
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