乙型肝炎病毒全基因組擴增方法研究進展
發布時間：2012-05-07 共1頁
hbv基因全長pcr擴增為hbv基因結構的多樣性與致病性和傳播途徑等關系的研究提供了全新的技術，在hbv研究中已顯示了巨大優越性。本文對該方法的幾個主要技術問題研究進展作了簡要綜述。
目前，研究hbv基因序列多樣性及其在病因和病毒蛋白表達上的作用已成為乙肝病毒研究的熱點[1，2].但多數研究僅限于某一基因片段的研究，通過pcr擴增個體內hbv基因群中的某些亞基因片段，然后直接測序。由于hbv基因內部有調控基因，基因片段間又相互重疊，很可能形成hbv不同基因群片段構成一個可供分析的hbv基因片段，使出現在單個基因分子上的突變復雜性及致病和傳播的關系無法精確和全面分析。有研究發現，由于病毒體內存在不同變異株，這種直接測部分序列的方法不能準確的提示病毒基因結構與病因及傳播的關系[3].而且，以往對hbv全基因的克隆需從大量血清中提取hbv，故難以對不同患者單一毒株作hbv全基因克隆。cunther等[4]于1995年建立了一種hbv全長聚合酶鏈反應（full-length，pcr），不需基因片段的重組，也不需要信賴基因中原有的限制性酶切位點，就可以從hbv低滴度血清中分離，克隆大量全長hbv基因，有效的擴增整個病毒dna序列，對有意義的毒株進行全基因測序，簡便的在基因結構水平進行基因突變，基因型及半定量研究，從而為研究hbv毒株的基因結構與功能提供了新的方法。現就擴增全長hbvdna幾個主要技術問題研究進展綜述如下：
1.引物的選擇
引物與模板的特異性結合，多聚酶對引物的有效延伸是pcr特異性及擴增效率的關鍵動力學因素。但是，hbv基因組的特殊結構限制了pcr引物的選擇，使擴增全基因極為困難。cunther等發現，如果延伸越過整個hbv基因序列中的兩個缺口區，與擴增連續的基因片段相比，效率約降低1000倍。因此，選擇位于缺口區的引物就可以避免延伸跨越缺口區。tellier等[5]設計了位于負鏈末端極保守區的引物，可以擴增大多數hbv感染者的完整基因。
同時，gunther等設計的引物中含有sapi，hind？以及ssti三個酶切位點。sapi的識別位點與酶切位點不同，故可通過用sapi酶切克降載體的hbv全基因，在已發表的39株hbv全基因中，僅有2株序列中含sapi酶切點，因而，用sspi酶切hbv全基因克降以獲得hbv完整的全基因適用于大多數hbv毒株。而所發表的hbv全基因分別只有4株和2株序列中含有hind？及ssti酶切位點，且沒有1株同時包含兩種酶切位點，引物中設計的hind？及ssti酶切點，有利于將擴增的片段克降入載體中。由于我國hbvadr株存在hind？酶切點但無sapi酶切點。何建文等在設計hbv全基因擴增時，將酶切序列由hind？改為sapi，也獲得了較好效果。
2.dna聚合酶的選擇
用于標準pcr的taq酶有很強的5＇→3＇聚合酶活性，但沒有3＇→5＇外切核酸作用無法消除擴增過程中出現的突變和由此產生的新合成的核酸鏈3＇端與模板鏈的錯配。因此taq聚合酶催化的反應，堿基錯誤摻入率可高達10-4/堿基/循環[6].用于全長pcr克降出單個dna分子，其序列則不太可靠，據gunther報道，expanchighfidelity擴增系統，用具有校閱功能的pwo聚合酶與taq酶的dna聚合酶混合物代替taq酶用于全長pcr，當擴增1fg的hbvdna，pcr產物為1ug時，人為造成的突變核苷酸僅為8.3kb，僅1個核苷酸突變。tellier等將klentaql與具有校閱功能的pfu酶按15：1混合，制成kla-16dna集合酶混合物，用于hbv全基因擴增，合成大片段dna的能力大大提高，人工突變率也很低。因此，在全長pcr中，在不影響hbv含量較低的血清擴增效率的同時應增加具有3‘→5’外切核酸酶活性的dna聚合酶，以雙聚合酶戰略消除dna合成中出現的引起pcr終止的錯配堿基而使產物得以繼續延伸，是保證擴增出的全長hbv基因序列可靠性的方法之一[7].已報道的有rtth和vent聚合酶的混合酶，am-plitaq酶與pfu按8∶1混合形成的advantageklentaqdna聚合酶混合物用于擴增大片段核酸均取得了較好成果。
3.模板的制備
模板dna的完整性是決定大片段核酸擴增的關鍵，常規制備模板dna的方法是用蛋白酶k等裂解液將血清或組織消化，然后經飽和酚和氯仿抽提，用乙醇沉淀后待擴增，有人比較過不同方法提取的dna模板對擴增大片段基因的影響，結果高鹽，大孔透析和陰離子交換樹脂等方法較傳統地酚提取方法能更好地保持模板dna的完整性。
4.熱啟動pcr
1991年d‘aquaila等[8]正式提出熱啟動pcr概念，即在高溫（70℃左右）下使酶，模板dna與引物混合，并與傳統pcr進行對比實驗，發現熱啟動rcr可顯著增加特異產物的量，減少非特異產物和背景，使低拷貝數病毒更易檢出，其后chou等[9]對這一技術與標準pcr進行了嚴密的實驗比較，證實室溫下加樣所形成的引物錯導和引物聚體是影響pcr特異性和敏感性的兩個重要原因。熱啟動可避免pcr反應中引物與模板的非特異性復性和擴增，這對擴增大片段核酸非常重要。gunther等在用expandhighfidelity擴增系統擴增全長hbv基因時，采用熱啟動方法，大大提高了基因擴增的特異性和靈敏性。
5.溫度循環參數
全長hbvpcr系統多采用退火和延伸結合的“雙溫”反應，或退火和延伸溫度極其接近，以提高擴增的特異性和效率，延伸溫度一般為68℃。gunther采用擴增全長hbvdnarcr反應程序是：每一循環94℃變性40s，60℃退火1.5min，68℃延伸3min，每10個循環增加延伸時間2min，共進行40個循環，由于在較后的循環中，產物濃度增大，酶減少，dntp減少，適當延長延伸時間可讓引物與模板充分結合，使聚合酶合成期望產物的長度，非特異性擴增也較少，同時盡可能減少熱循環次數以減少pcr誘導的錯配率。tellier等擴增全長hbvdnapcr反應共進行了35個循環，并采用不同的延伸時間作比較，最終發現，最初25個循環每循環延伸6min，后10個循環延伸12min，可達到最佳的擴增效率。
6.應用
hbv全長pcr擴增為hbv基因結構和多樣性與致病性和傳播途徑等關系的研究提供了全新的技術，在hbv研究中已顯示了巨大的優越性。sommer等[10]對10例乙肝病人的血清中hbvdna做全長pcr擴增，發現4例病人基因序列中含有約60到100個核苷長度的poly（da）序列，提示hbvp蛋白選擇具有poly（a）尾的病毒前基因組rna作為反轉錄的模板，引起dna負鏈發生突變，變異株的產生導致hbv致病性和臨床表現的明顯改變。gunther等[11]從7例乙型肝炎病毒攜帶者中用全長pcr分離出大量含缺失突變的hbv基因，經克隆，測序等分析發現，由拼接的前基因rna包裝和反轉錄產生了有缺失突變的hbv基因，提示有特殊的“拼接”基因變異株存在，并證明其與乙型肝炎慢性感染有密切關系。突破了以往根據基因片段只能研究“單一拼接”基因而不能檢出其它拼接基因的局限性。最后，sterneck等[12]應用該方法hbsag陽性母親與出生后發生暴發性肝炎的嬰兒hbv基因結構的研究。結果表明前c區終止碼突變。c區t-1762和a-1760突變以及前s2啟動碼變可能是暴發性肝炎發生的原因。因此，利用全長hbvpcr可進行hbv全長序列與hbv復制，表達的研究及從基因水平入手，進行乙型肝炎致病因素與傳播機理的探索，并可從總體上把握致病基因間的相互關系。可以預料，hbv全長pcr將大大推進對hbv毒株結構和功能的研究。
自全長pcr技術開展以來，已陸續的用于多種病毒基因結構的研究。1995年salminen等[13]首次用此技術直接擴增來自不同組織的hiv1全長dna，并構建了具有完全復制能力的hivi病毒克隆，為hiv的研究提供了新的方法。全長pcr在人類乳頭瘤病毒[14]，hav[15]等基因結構的研究都取得了良好的效果。但由于全長基因擴增的技術困難較大，影響因素較多，目前還很難應用在其它病毒方面。隨著pcr技術的提高，全長基因擴增將會有更廣泛的應用。
