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　　hbv基因全長(zhǎng)pcr擴(kuò)增為hbv基因結(jié)構(gòu)的多樣性與致病性和傳播途徑等關(guān)系的研究提供了全新的技術(shù)，在hbv研究中已顯示了巨大優(yōu)越性。本文對(duì)該方法的幾個(gè)主要技術(shù)問題研究進(jìn)展作了簡(jiǎn)要綜述。

　　目前，研究hbv基因序列多樣性及其在病因和病毒蛋白表達(dá)上的作用已成為乙肝病毒研究的熱點(diǎn)[1，2].但多數(shù)研究?jī)H限于某一基因片段的研究，通過pcr擴(kuò)增個(gè)體內(nèi)hbv基因群中的某些亞基因片段，然后直接測(cè)序。由于hbv基因內(nèi)部有調(diào)控基因，基因片段間又相互重疊，很可能形成hbv不同基因群片段構(gòu)成一個(gè)可供分析的hbv基因片段，使出現(xiàn)在單個(gè)基因分子上的突變復(fù)雜性及致病和傳播的關(guān)系無法精確和全面分析。有研究發(fā)現(xiàn)，由于病毒體內(nèi)存在不同變異株，這種直接測(cè)部分序列的方法不能準(zhǔn)確的提示病毒基因結(jié)構(gòu)與病因及傳播的關(guān)系[3].而且，以往對(duì)hbv全基因的克隆需從大量血清中提取hbv，故難以對(duì)不同患者單一毒株作hbv全基因克隆。cunther等[4]于1995年建立了一種hbv全長(zhǎng)聚合酶鏈反應(yīng)（full-length，pcr），不需基因片段的重組，也不需要信賴基因中原有的限制性酶切位點(diǎn)，就可以從hbv低滴度血清中分離，克隆大量全長(zhǎng)hbv基因，有效的擴(kuò)增整個(gè)病毒dna序列，對(duì)有意義的毒株進(jìn)行全基因測(cè)序，簡(jiǎn)便的在基因結(jié)構(gòu)水平進(jìn)行基因突變，基因型及半定量研究，從而為研究hbv毒株的基因結(jié)構(gòu)與功能提供了新的方法。現(xiàn)就擴(kuò)增全長(zhǎng)hbvdna幾個(gè)主要技術(shù)問題研究進(jìn)展綜述如下：

　　1.引物的選擇

　　引物與模板的特異性結(jié)合，多聚酶對(duì)引物的有效延伸是pcr特異性及擴(kuò)增效率的關(guān)鍵動(dòng)力學(xué)因素。但是，hbv基因組的特殊結(jié)構(gòu)限制了pcr引物的選擇，使擴(kuò)增全基因極為困難。cunther等發(fā)現(xiàn)，如果延伸越過整個(gè)hbv基因序列中的兩個(gè)缺口區(qū)，與擴(kuò)增連續(xù)的基因片段相比，效率約降低1000倍。因此，選擇位于缺口區(qū)的引物就可以避免延伸跨越缺口區(qū)。tellier等[5]設(shè)計(jì)了位于負(fù)鏈末端極保守區(qū)的引物，可以擴(kuò)增大多數(shù)hbv感染者的完整基因。

　　同時(shí)，gunther等設(shè)計(jì)的引物中含有sapi，hind？以及ssti三個(gè)酶切位點(diǎn)。sapi的識(shí)別位點(diǎn)與酶切位點(diǎn)不同，故可通過用sapi酶切克降載體的hbv全基因，在已發(fā)表的39株hbv全基因中，僅有2株序列中含sapi酶切點(diǎn)，因而，用sspi酶切hbv全基因克降以獲得hbv完整的全基因適用于大多數(shù)hbv毒株。而所發(fā)表的hbv全基因分別只有4株和2株序列中含有hind？及ssti酶切位點(diǎn)，且沒有1株同時(shí)包含兩種酶切位點(diǎn)，引物中設(shè)計(jì)的hind？及ssti酶切點(diǎn)，有利于將擴(kuò)增的片段克降入載體中。由于我國(guó)hbvadr株存在hind？酶切點(diǎn)但無sapi酶切點(diǎn)。何建文等在設(shè)計(jì)hbv全基因擴(kuò)增時(shí)，將酶切序列由hind？改為sapi，也獲得了較好效果。

　　2.dna聚合酶的選擇

　　用于標(biāo)準(zhǔn)pcr的taq酶有很強(qiáng)的5＇→3＇聚合酶活性，但沒有3＇→5＇外切核酸作用無法消除擴(kuò)增過程中出現(xiàn)的突變和由此產(chǎn)生的新合成的核酸鏈3＇端與模板鏈的錯(cuò)配。因此taq聚合酶催化的反應(yīng)，堿基錯(cuò)誤摻入率可高達(dá)10-4/堿基/循環(huán)[6].用于全長(zhǎng)pcr克降出單個(gè)dna分子，其序列則不太可靠，據(jù)gunther報(bào)道，expanchighfidelity擴(kuò)增系統(tǒng)，用具有校閱功能的pwo聚合酶與taq酶的dna聚合酶混合物代替taq酶用于全長(zhǎng)pcr，當(dāng)擴(kuò)增1fg的hbvdna，pcr產(chǎn)物為1ug時(shí)，人為造成的突變核苷酸僅為8.3kb，僅1個(gè)核苷酸突變。tellier等將klentaql與具有校閱功能的pfu酶按15：1混合，制成kla-16dna集合酶混合物，用于hbv全基因擴(kuò)增，合成大片段dna的能力大大提高，人工突變率也很低。因此，在全長(zhǎng)pcr中，在不影響hbv含量較低的血清擴(kuò)增效率的同時(shí)應(yīng)增加具有3‘→5’外切核酸酶活性的dna聚合酶，以雙聚合酶戰(zhàn)略消除dna合成中出現(xiàn)的引起pcr終止的錯(cuò)配堿基而使產(chǎn)物得以繼續(xù)延伸，是保證擴(kuò)增出的全長(zhǎng)hbv基因序列可靠性的方法之一[7].已報(bào)道的有rtth和vent聚合酶的混合酶，am-plitaq酶與pfu按8∶1混合形成的advantageklentaqdna聚合酶混合物用于擴(kuò)增大片段核酸均取得了較好成果。

　　3.模板的制備

　　模板dna的完整性是決定大片段核酸擴(kuò)增的關(guān)鍵，常規(guī)制備模板dna的方法是用蛋白酶k等裂解液將血清或組織消化，然后經(jīng)飽和酚和氯仿抽提，用乙醇沉淀后待擴(kuò)增，有人比較過不同方法提取的dna模板對(duì)擴(kuò)增大片段基因的影響，結(jié)果高鹽，大孔透析和陰離子交換樹脂等方法較傳統(tǒng)地酚提取方法能更好地保持模板dna的完整性。

　　4.熱啟動(dòng)pcr

　　1991年d‘a(chǎn)quaila等[8]正式提出熱啟動(dòng)pcr概念，即在高溫（70℃左右）下使酶，模板dna與引物混合，并與傳統(tǒng)pcr進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)熱啟動(dòng)rcr可顯著增加特異產(chǎn)物的量，減少非特異產(chǎn)物和背景，使低拷貝數(shù)病毒更易檢出，其后chou等[9]對(duì)這一技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)pcr進(jìn)行了嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)比較，證實(shí)室溫下加樣所形成的引物錯(cuò)導(dǎo)和引物聚體是影響pcr特異性和敏感性的兩個(gè)重要原因。熱啟動(dòng)可避免pcr反應(yīng)中引物與模板的非特異性復(fù)性和擴(kuò)增，這對(duì)擴(kuò)增大片段核酸非常重要。gunther等在用expandhighfidelity擴(kuò)增系統(tǒng)擴(kuò)增全長(zhǎng)hbv基因時(shí)，采用熱啟動(dòng)方法，大大提高了基因擴(kuò)增的特異性和靈敏性。

　　5.溫度循環(huán)參數(shù)

　　全長(zhǎng)hbvpcr系統(tǒng)多采用退火和延伸結(jié)合的“雙溫”反應(yīng)，或退火和延伸溫度極其接近，以提高擴(kuò)增的特異性和效率，延伸溫度一般為68℃。gunther采用擴(kuò)增全長(zhǎng)hbvdnarcr反應(yīng)程序是：每一循環(huán)94℃變性40s，60℃退火1.5min，68℃延伸3min，每10個(gè)循環(huán)增加延伸時(shí)間2min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，由于在較后的循環(huán)中，產(chǎn)物濃度增大，酶減少，dntp減少，適當(dāng)延長(zhǎng)延伸時(shí)間可讓引物與模板充分結(jié)合，使聚合酶合成期望產(chǎn)物的長(zhǎng)度，非特異性擴(kuò)增也較少，同時(shí)盡可能減少熱循環(huán)次數(shù)以減少pcr誘導(dǎo)的錯(cuò)配率。tellier等擴(kuò)增全長(zhǎng)hbvdnapcr反應(yīng)共進(jìn)行了35個(gè)循環(huán)，并采用不同的延伸時(shí)間作比較，最終發(fā)現(xiàn)，最初25個(gè)循環(huán)每循環(huán)延伸6min，后10個(gè)循環(huán)延伸12min，可達(dá)到最佳的擴(kuò)增效率。

　　6.應(yīng)用

　　hbv全長(zhǎng)pcr擴(kuò)增為hbv基因結(jié)構(gòu)和多樣性與致病性和傳播途徑等關(guān)系的研究提供了全新的技術(shù)，在hbv研究中已顯示了巨大的優(yōu)越性。sommer等[10]對(duì)10例乙肝病人的血清中hbvdna做全長(zhǎng)pcr擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)4例病人基因序列中含有約60到100個(gè)核苷長(zhǎng)度的poly（da）序列，提示hbvp蛋白選擇具有poly（a）尾的病毒前基因組rna作為反轉(zhuǎn)錄的模板，引起dna負(fù)鏈發(fā)生突變，變異株的產(chǎn)生導(dǎo)致hbv致病性和臨床表現(xiàn)的明顯改變。gunther等[11]從7例乙型肝炎病毒攜帶者中用全長(zhǎng)pcr分離出大量含缺失突變的hbv基因，經(jīng)克隆，測(cè)序等分析發(fā)現(xiàn)，由拼接的前基因rna包裝和反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了有缺失突變的hbv基因，提示有特殊的“拼接”基因變異株存在，并證明其與乙型肝炎慢性感染有密切關(guān)系。突破了以往根據(jù)基因片段只能研究“單一拼接”基因而不能檢出其它拼接基因的局限性。最后，sterneck等[12]應(yīng)用該方法hbsag陽性母親與出生后發(fā)生暴發(fā)性肝炎的嬰兒hbv基因結(jié)構(gòu)的研究。結(jié)果表明前c區(qū)終止碼突變。c區(qū)t-1762和a-1760突變以及前s2啟動(dòng)碼變可能是暴發(fā)性肝炎發(fā)生的原因。因此，利用全長(zhǎng)hbvpcr可進(jìn)行hbv全長(zhǎng)序列與hbv復(fù)制，表達(dá)的研究及從基因水平入手，進(jìn)行乙型肝炎致病因素與傳播機(jī)理的探索，并可從總體上把握致病基因間的相互關(guān)系。可以預(yù)料，hbv全長(zhǎng)pcr將大大推進(jìn)對(duì)hbv毒株結(jié)構(gòu)和功能的研究。

　　自全長(zhǎng)pcr技術(shù)開展以來，已陸續(xù)的用于多種病毒基因結(jié)構(gòu)的研究。1995年salminen等[13]首次用此技術(shù)直接擴(kuò)增來自不同組織的hiv1全長(zhǎng)dna，并構(gòu)建了具有完全復(fù)制能力的hivi病毒克隆，為hiv的研究提供了新的方法。全長(zhǎng)pcr在人類乳頭瘤病毒[14]，hav[15]等基因結(jié)構(gòu)的研究都取得了良好的效果。但由于全長(zhǎng)基因擴(kuò)增的技術(shù)困難較大，影響因素較多，目前還很難應(yīng)用在其它病毒方面。隨著pcr技術(shù)的提高，全長(zhǎng)基因擴(kuò)增將會(huì)有更廣泛的應(yīng)用。