2018初級藥師資格考試《相關專業知識》復習講義第九章
發布時間：2018-01-02 共1頁
第九章 生物技術藥物制劑
第一節概述
一、生物技術的基本概念
1、生物技術或稱生物工程(biotechnology)，是應用生物體(包括微生物、動物細胞， 植物細胞)或其組成部分(細胞器和酶)，在最適條件下，生產有價值的產物或進行有益過程的技術。
2、現代生物技術主要包括基因工程、細胞工程與酶工程、發酵工程(微生物工程)與生 化工程。
二、生物技術藥物的結構特點與理化性質
(一)蛋白質的結構特點 蛋白質的組成和一般結構(一、二、三、四級結構)(二)蛋白質的理化性質
1.蛋白質的一般理化性質：旋光性、紫外吸收、蛋白質兩性本質與電學性質
(1)旋光性：蛋白質分子總體旋光性由構成氨基酸各個旋光度的總和決定，通常是右旋，它由螺旋結構引起。蛋白質變性，螺旋結構松開，則其左旋性增大。
(2)紫外吸收：大部分蛋白質均含有帶苯核的苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm顯示強吸收。
(3)蛋白質兩性本質與電學性質：蛋白質除了肽鏈N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的側鏈上還有很多解離基團，如賴氨酸的-氨基，谷氨酸的γ羧基等。這些基團在一定 pH條件下都能發生解離而帶電。因此蛋白質是兩性電解質，在不同 pH條件下蛋白質會成為陽離子、陰離子或二性離子。
2.蛋白質的不穩定性
(1)由于共價鍵引起的不穩定性：水解、氧化和消旋化，此外還有蛋白質的特有反應，即二硫鍵的斷裂與交換
(2)由非共價鍵引起的不穩定性：聚集(aggregation)、宏觀沉淀、表面吸附與蛋白質變性
(三)蛋白質類藥物的評價方法： 多種分析方法：液相色譜法、光譜法、電泳、生物活性測定與免疫測定
第二節 蛋白質類藥物制劑的處方與工藝(注射劑型)
一、蛋白質類藥物的一般處方組成：一類為溶液型注射劑，另一類是凍干粉注射劑
二、液體劑型中蛋白質類藥物的穩定化：①改造其結構;②加入適宜輔料 蛋白類藥物的穩定劑：緩沖液、表面活性劑、糖和多元醇、鹽類、聚乙二醇類、大分子化合物、組氨酸、甘氨酸、谷氨酸和賴氨酸的鹽酸鹽等、金屬離子
1.緩沖液 因為蛋白質的物理化學穩定性與pH值有關，通常蛋白質的穩定pH值范圍很窄，應采用適當的緩沖系統，以提高蛋白質在溶液中的穩定性。例如紅細胞生成素采用枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖劑，而α-N3干擾素則用磷酸鹽緩沖系統，人生長激素在5mmol/L的磷酸鹽緩沖液可減少聚集。緩沖鹽類除了影響蛋白質的穩定性外，其濃度對蛋白質的溶解度與聚集均有很大影響。組織溶纖酶原激活素在最穩定的pH條件下，藥物的溶解度不足以產生治療效果，因此加入帶正電荷的精氨酸以增加蛋白質在所需pH值下的溶解度。
2.表面活性劑 由于離子型表面活性劑會引起蛋白質的變性，所以在蛋白質藥物，如α-2b干擾素、G-CSF、組織溶纖酶原激活素等制劑中均加入少量非離子表面活性劑，如吐溫80來抑制蛋白質的聚集，其機理可能是因為表面活性劑傾向于排列在氣—液界面上，從而使蛋白質離開界面來抑制蛋白質的變性。
3.糖和多元醇 糖和多元醇屬于非特異性蛋白質穩定劑。蔗糖、海藻糖、甘油、甘露醇、山梨醇(濃度1%~10%)最常用。糖和多元醇的穩定作用與其濃度密切相關，不同糖和多元醇的穩定程度取決于蛋白質的種類。還原糖與氨基酸有相互作用，因此避免使用。
4.鹽類 鹽可以起到穩定蛋白質的作用，有時也可以破壞蛋白質的穩定性，這主要取決于鹽的種類、濃度、離子相互作用的性質及蛋白質的電荷。低濃度的鹽通過非特異性靜電作用提高蛋白質的穩定性。如SO42-、HPO42-、CHCOO-、(CH3)N+、NH4+、K+、Na+等能增加溶液的離子強度，提高疏水作用，降低疏水基團的溶解度，使蛋白質發生鹽析。此外它們使水分子聚集在蛋白質周圍被優先水化，所有這些都使蛋白質更加緊密穩定。經常使用的鹽NaCl在穩定蛋白質中起關鍵作用，實驗表明它能提高牛血清白蛋白(BSA)的變性溫度和熱焓。
5.聚乙二醇類 高濃度的聚乙二醇類常作為蛋白質的低溫保護劑和沉淀結晶劑。研究表明不同分子量的PEG作用不同，如PEG300濃度0.5%或2%可抑制重組人角化細胞生長因子(rhKGF)的聚集;PEG200、400、600和1000可穩定BSA和溶菌酶。
6.大分子化合物 研究表明很多大分子化合物具有穩定蛋白質的作用。其機制可能是通過大分子的表面活性、蛋白質-蛋白質相互作用的空間隱蔽以及提高粘度來限制蛋白質運動或通過優先吸附于大分子以起到穩定作用，人血清白蛋白(HAS)已在許多蛋白質類生物技術來源的藥物制劑中作穩定劑。近年來也有采用環糊精制成包合物來增加蛋白質藥物的溶解度，例如用2-羥丙基--環糊精是較有前途的穩定劑，其本身又是增溶劑可靜脈注射，可用來抑制hGH的界面變性，抑制rhKGF的聚集，穩定白介素-2和牛胰島素等。
7.組氨酸、甘氨酸、谷氨酸和賴氨酸的鹽酸鹽等 可不同程度地抑制45℃ 10 mM磷酸鹽緩沖液中rhKGF的聚集。
8.金屬離子 一些金屬離子，如鈣、鎂、鋅與蛋白質結合，使整個蛋白質結構更加緊密、結實、穩定。不同金屬離子的穩定作用視離子的種類、濃度不同而不同，應通過穩定性實驗選擇金屬離子的種類和濃度。
三、固體狀態蛋白質藥物的穩定性與工藝 (一)冷凍干燥蛋白質藥物制劑：在蛋白質類藥物凍干過程中常加入某些凍干保護劑來改善產品的外觀和穩定性，如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、右旋糖酐等。 (二)噴霧干燥蛋白質藥物制劑：操作過程中損失大(特別是小規模生產)，水分含量高。
第三節 蛋白質類藥物新型給藥系統
一、新型注射(植入)給藥系統
(一)控釋微球制劑：復乳液中干燥法、低溫噴霧提取法、噴霧干燥法、超臨界萃取法
1.復乳液中干燥法
將藥物與保護劑(多為水溶性高分子聚合物)溶于水作為水相，將聚酯(如PLA、PLGA等)類高分子材料溶于二氯甲烷作為油相，兩者在一定溫度下(低于40℃)高速攪拌得W/O型初乳，冰浴冷卻至10℃以下，倒至一定濃度的PVA水溶液中，經高速攪拌得W/O/W型復乳，一定溫度下攪拌蒸去有機溶劑固化微球(或減壓去有機溶劑)，離心水洗，真空干燥即得。該方法是制備多肽、蛋白質等生物大分子藥物微球的常用方法，其特點為藥物包封率較高，藥物活性損失小，設備和工藝簡單，但首日突釋明顯，較難放大生產，目前用此法研究制備的藥物有γ干擾素、白細胞介素、亮丙瑞林、人生長激素、環孢素以及促紅細胞生長素(EPO)等。
2.低溫噴霧提取法
將生物大分子藥物與保護劑的均勻粉末加至生物可降解性聚合物的有機溶劑(如二氯甲烷)中混合形成混懸液，將此混懸液經噴頭霧化后噴入冰凍的乙醇溶液(該溶液可與上述溶液混溶，但聚合物不溶于此溶液)，在低溫(-70℃)狀態下，聚合物載體中的有機溶劑在乙醇中不斷擴散完全，分離微球，低溫干燥除去乙醇得粉末狀微球，該方法的特點：包封率高，微球粒徑集中，工藝穩定，可實現產業化，但其活性損失較復乳液中干燥法大。
3.噴霧干燥法
將生物大分子藥物及其穩定劑的混合粉末(或水溶液)與溶有高分子聚合物的有機溶液混合形成混懸液(或乳濁液)，將此混懸液(或乳濁液)經噴嘴霧化干燥制得微球。為了減少生物活性損失，文獻報道采用雙噴嘴噴霧干燥裝置進行生物大分子藥物微球的制備，可明顯增加微球的收率，同時可減少多肽、蛋白質類藥物的活性損失。該裝置具有兩個平行噴嘴，其中一個噴嘴噴出藥物和聚合物的混懸液(或乳濁液)，另一噴嘴同時噴出5%的甘露醇溶液，將微球包層，這樣可避免普通噴霧干燥裝置制備微球過程中易粘附器壁的缺陷。
4.超臨界萃取法
超臨界萃取技術是從20世紀80年代逐漸發展起來的一門新技術。近年來，超臨界萃取技術已在化工、冶金、食品、醫藥、生物等領域得到廣泛應用。超臨界流體既具有對溶質有較大溶解度的特點，又具有氣體易于擴散和運動的特性。更重要的是在臨界點附近，壓力和溫度微小的變化都可以引起流體密度很大的變化，并相應地表現為溶解度的變化。因此，人們可以利用壓力、溫度的變化來實現萃取和分離的過程而成為實現藥物多組分分離的一種有效方法。人們將此技術應用于微粒給藥系統，制備藥物的控釋聚合物微球、藥物結晶的粉末、控釋脂質體藥物等。在制備微粒中根據聚合物及藥物的溶解特性又分為超臨界溶液快速膨脹(rapid expansion of supercritical solution，RESS)技術和氣體反溶劑(gas antisolution，GAS)技術。RESS技術的操作過程是：將固體物質在一定的溫度和壓力下溶解在超臨界流體中形成溶液，然后將此高壓溶液從一個細小的噴嘴(一般噴嘴的內徑為幾十微米，長約幾個毫米)噴射到常壓的空間中，由于超臨界流體在減壓的過程中變成了氣體，溶解在其中的溶質就沉淀析出，產生直徑從幾百納米到幾個微米左右的顆粒。一個典型的成功例子是包埋在聚乳酸小球中的Lovastatin晶體。顆粒的構型可以通過適當改變壓力、溫度、溶液濃度以及噴嘴幾何形裝來調節。因此用RESS技術得到的固體顆粒都在微米級而且粒徑分布比較均勻。
(二)脈沖式給藥系統：
二、非注射給藥系統
(一)鼻腔給藥系統
(二)口服給藥系統：納米囊、胰島素腸溶軟膠囊、胰島素微球制劑、胰島素脂質體存在四個問題：①在胃內酸催化降解;②在胃腸道內的酶水解;③對胃腸道粘膜的透過性差;④在肝的首過效應。
(三)直腸給藥系統(四)口腔粘膜給藥系統(五)經皮給藥系統(六)肺部給藥系統
第四節蛋白質類藥物制劑的評價方法
一、制劑中藥物的含量測定
制劑中蛋白質類藥物的含量測定可根據處方組成確定，如紫外分光光度法和反相高效液相色譜法常用于測定溶液中蛋白質的濃度，但必須進行方法的適用性試驗，在處方中其他物質不干擾藥物測定的前提下，將蛋白質類藥物制劑溶于1.0N氫氧化鈉溶液中后采用292nm波長條件下的紫外分光光度法測定。也可采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)、離子交換色譜(IEC)與分子排阻色譜(Size exclusion chromatography，SEC)法測定。
二、制劑中藥物的活性測定
蛋白質類藥物制劑中藥物的活性測定是評價制劑工藝可行性的重要方面，活性測定方法有藥效學方法(如細胞病變抑制法)和放射免疫測定法。前一種方法是利用體外細胞與活性蛋白質多肽的特異生物學反應，通過劑量(或濃度)效應曲線進行定量(絕對量或比活性單位)，該方法具有結果可靠，方法重現性好的特點，是制訂藥物制劑質量標準最基本的方法。后一種方法是建立在蛋白質類藥物的活性部位與抗原決定簇處在相同部位時實施的一種方法，否則活性測定會產生誤差。此外也可采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法測定蛋白質類藥物活性。
三、制劑中藥物的體外釋藥速率測定
測定控緩釋制劑中蛋白質類藥物的體外釋藥速率時考慮到藥物在溶出介質中不穩定，多采用測定制劑中未釋放藥物量的方法。具體方法(以微球為例)是將數個試驗組的微球(每個試驗組設置數個取樣點)置于一定量的溶出介質中，放入37℃振動孵箱中，定時取樣離心分離測定微球中藥物含量。蛋白質從微球中的釋放受介質pH值、離子強度、賦形劑以及轉速、溫度等條件的影響。
四、制劑的穩定性研究
蛋白質類藥物制劑的穩定性研究應包括制劑的物理穩定性和化學穩定性兩個方面，物理穩定性研究應包括制劑中藥物的溶解度、釋放速率以及藥典規定的制劑常規指標的測定，化學穩定性包括藥物的聚集穩定性、降解穩定性和生物活性測定。試驗方法可參照藥物制劑穩定性章節，檢測手段根據不同藥物的特性選擇光散射法、圓二色譜法、電泳法、分子排阻色譜法和細胞病變抑制法等進行測定。
五、體內藥動學研究
由于蛋白質類藥物劑量小，體內血藥濃度檢測的靈敏度要求高，常規體外檢測方法不能滿足體內血藥濃度測定，此外藥物進入體內后很快被分解代謝，因此選擇合適的檢測方法是進行體內藥動學研究的關鍵。對于非靜脈給藥的控緩釋制劑的體內藥動學試驗可考慮選擇放射標記法測定血漿中藥物的量，該方法靈敏度高，適合多數蛋白質類藥物體內血藥濃度的測定。如果藥物血藥濃度與藥效學呈線性關系，也可用藥效學指標代替血藥濃度進行體內吸收和藥動學研究。
六、刺激性及生物相容性研究
與其他類型藥物制劑研究一樣，刺激性及生物相容性研究是蛋白質類藥物制劑(特別是各類注射劑)研究與開發的重要一環，根據我國SFDA(State Food and Drug Administration)藥品注冊管理辦法規定，皮膚、粘膜及各類腔道用藥需進行局部毒性和刺激性試驗，各類注射(植入)途徑給藥劑型除進行局部毒性和刺激性試驗外還需進行所用輔料的生物相容性研究，以確保所用輔料的安全性。
思考題： 1、何謂生物技術制劑
2、以蛋白質藥物制劑為例，試述其一般處方組成及如何增強其藥物穩定性
小結： 1、掌握生物技術藥物制劑的概念;
2、熟悉蛋白質類藥物制劑的處方與工藝及穩定性考察。
3、了解蛋白質藥物的結構特點、理化性質及新的給藥系統及評價方法。
