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　　脂酰CoA進入線粒體基質后，在脂肪酸β氧化酶系催化下，進行脫氫、加水，再脫氫及硫解4步連續反應，最后使脂酰基斷裂生成一分子乙酰CoA和一分子比原來少了兩個碳原子的脂酰CoA. 因反應均在脂酰CoA烴鏈的α，β碳原子間進行，最后β碳被氧化成酰基，故稱為β氧化。

　　a　脫氫：脂酰CoA在脂酰基CoA脫氫酶的催化下，其烴鏈的α、β位碳上各脫去一個氫原子，生成α、β烯脂酰CoA(trans-y-enoyl CoA)，脫下的兩個氫原子由該酶的輔酶FAD接受生成FAD.2H.后者經電子傳遞鏈傳遞給氧而生成水，同時伴有兩分子ATP的生成。

　　b　加水：α、β烯脂酰CoA在烯酰CoA水合酶的催化下，加水生成β-羥脂酰CoA(βhydroxy acylCoA)。

　　c　再脫氫：β-羥脂酰CoA在β-羥脂酰CoA脫氫酶(L-βhydroxy acyl CoAdehydrogenase)催化下，脫去β碳上的2個氫原子生成β-酮脂酰CoA，脫下的氫由該酶的輔酶NAD+接受，生成NADH+H+ .后者經電子傳遞鏈氧化生成水及3分子ATP.

　　d　硫解：β-酮脂酰CoA在β-酮脂酰CoA在硫解酶(β-ketoacylCoA thiolase)催化下，加一分子CoA SH使碳鏈斷裂，產生乙酰CoA和一個比原來少兩個碳原子的脂酰CoA.以上4步反應均可逆行，但全過程趨向分解，尚無明確的調控位點。